CRISPR/Cas9（規(guī)律成簇的間隔短回文重復序列及相關蛋白9）核酸酶表達載體屬于幾種新興的基因組編輯工具之一（另外兩種是ZFN和TALEN），可在基因組的靶位點快速有效地產(chǎn)生突變。這些質(zhì)粒載體編碼的特異性RNA，能夠引導DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位點的DNA序列。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統(tǒng)的一部分，賦予細菌產(chǎn)生對質(zhì)粒和噬菌體等外源遺傳物質(zhì)的抵抗能力。在細胞內(nèi)，Cas9核酸酶與引導RNA（gRNA）形成復合物，該復合物通過與基因組中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA與靶位點通過互補配對使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因組中的靶位點。

使用CRISPR打靶目的基因需要目標細胞同時表達Cas9和特異gRNA。這可以通過在同一個載體上共表達Cas9和gRNA，也可以通過在兩個載體各上自表達Cas9和gRNA來實現(xiàn)。使用Cas9和gRNA兩個載體分開表達的優(yōu)勢在于可使用不同的gRNA與不同的Cas9變體組合（如野生型Cas9，Cas9n，dCas9），從而根據(jù)實驗目的帶來更多變的實驗方案。此外，使用單獨的Cas9表達載體還可以構建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，獲得比質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)更均一和高水平的Cas9蛋白表達。

我們的Cas9表達piggyBac載體是將Cas9基因永久導入一系列類型的哺乳細胞的有效而又簡便的工具?；赑iggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導方式可以利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而非病毒轉(zhuǎn)導的方法就能將Cas9表達框永久整合宿主基因組。PiggyBac系統(tǒng)包含兩個載體，一個載體被稱為輔助質(zhì)粒，負責編碼轉(zhuǎn)座酶；另一個載體被稱為轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，包含兩個末端重復序列（ITR）以及兩者之間的被轉(zhuǎn)座區(qū)域，需要被轉(zhuǎn)座到宿主基因組中的Cas9表達框就克隆在這個區(qū)域。

當輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染靶細胞時，輔助質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶將會識別轉(zhuǎn)座子的兩個ITR元件，然后將被轉(zhuǎn)座區(qū)和兩個ITR元件插入到宿主基因組中。PiggyBac屬于II類轉(zhuǎn)座子，通過“剪切—粘貼”的機制移動，從一個地方轉(zhuǎn)座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好相反，I類轉(zhuǎn)座子是通過“復制—粘貼”的方式移動）。由于輔助質(zhì)粒是通過瞬時轉(zhuǎn)染進入宿主細胞的，故會逐漸丟失。隨著輔助質(zhì)粒的丟失，轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中變成了永久整合。當這些宿主細胞再次被輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，整合的轉(zhuǎn)座子會再次通過“剪切—粘貼”的機制移動。

我們提供多種版本的來源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。這其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，只對靶序列的DNA單鏈造成切口；dCas9，bao'hanD10A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，親和性強化的SpCas9；以及eSpCas9，特異性強化的SpCas9。dCas9融合轉(zhuǎn)錄激活結構域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合轉(zhuǎn)錄抑制結構域后，如dCas9/KRAB，可分別應用于CRISPRa和CRISPRi系統(tǒng)。此外，我們提供的來源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和來源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統(tǒng)。AsCpf1造成DSB時，兩條DNA鏈上的切口位置相互錯開，形成粘性末端）。

關于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

我們的Cas9表達piggyBac載體以及其輔助質(zhì)粒經(jīng)優(yōu)化后在大腸桿菌體內(nèi)具有很高的拷貝數(shù)，并且對大多數(shù)宿主細胞具有高效的轉(zhuǎn)導能力。Cas9表達piggyBac載體可實現(xiàn)用戶自定義啟動子驅(qū)動下的高水平Cas9表達。當Cas9與靶點特異的gRNA結合后，可對靶位點進行高效的打靶。我們可提供多種類型的Cas9蛋白以滿足不同的實驗需求。

外源基因的永久整合：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染只能實現(xiàn)外源基因的瞬時表達，這種外源基因會隨著宿主細胞的分裂而不斷丟失，在快速分裂的細胞中顯得尤為顯著。相反，將PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體和輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中，由于轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的作用下，目的基因能穩(wěn)定地整合到宿主細胞的染色體中，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子載體上攜帶的目的基因在宿主細胞中永久表達。

技術簡單：通過常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，相比起病毒載體需要進行病毒包裝，過程更簡單。

載體容量大：我們的轉(zhuǎn)座子載體總?cè)萘靠蛇_30kb，其中質(zhì)粒骨架只占3kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

轉(zhuǎn)染細胞類型受限：PiggyBac載體進入細胞依賴于轉(zhuǎn)染。不同類型的細胞，其轉(zhuǎn)染效率差異非常大。非分裂細胞通常比分裂細胞更難轉(zhuǎn)染，原代細胞比永生化細胞更難轉(zhuǎn)染，一些重要的細胞類型轉(zhuǎn)染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染主要局限于體外應用，很少應用于體內(nèi)實驗（但可以應用于轉(zhuǎn)基因動物模型制備）。以上因素在一定程度上制約了PiggyBac系統(tǒng)的應用。

PAM序列依賴: CRISPR/Cas9靶向特定位點時對gRNA識別序列3'端的PAM序列有嚴格要求。不同類型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the piggyBac transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome. 

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.